细胞周期蛋白依赖性激酶PFTK1在少突胶质前体细胞分化中的潜在作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.07.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：少突胶质细胞主要来自少突胶质前体细胞，该分化过程被多种因子严格调控。一些细胞周期蛋白依赖性激酶可以调控少突胶质前体细胞分化的早期阶段，对少突胶质细胞形成具有重要意义。

目的：分析细胞周期蛋白依赖性激酶PFTK1在少突胶质前体细胞分化中的潜在作用及相应机制。

方法：利用siRNA技术和Western印迹实验来检测OLN-93细胞分化的相关分子标志物及相应信号通路的活化情况。

结果与结论：撤去血清后，少突胶质前体细胞系OLN-93细胞可进行自发分化。形态观察表明，用siRNA技术沉默PFTK1基因表达后，OLN-93细胞的分化得以明显加快。Western印迹实验显示PFTK1基因沉默后，OLN-93分化的相关分子标志物环核苷酸磷酸二酯酶和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的诱导出现显著增加。对PFTK1相关信号通路的研究则发现，PFRK1基因的沉默表达可诱发PI3K/AKT信号通路的活化。而对PI3K/AKT信号通路的特异性抑制可抵消PFTK1沉默对OLN-93细胞分化的促进效果。实验结果首次发现细胞周期蛋白依赖性激酶PFTK1可通过PI3K/AKT信号通路抑制少突胶质前体细胞的分化，为脱髓鞘引起的神经退化性疾病的治疗提供了重要的理论参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 少突胶质细胞, 少突胶质前体细胞, PFTK1, 分化, 基因沉默

Abstract:

BACKGROUND: Oligodendrocytes are mainly differentiated from oligodendrocyte precursor cells and the differentiation is tightly regulated by various factors. Some cyclin-dependent kinases play pivotal roles in oligodendrocyte precursor cell differentiation due to their regulation on the early stage of differentiation.

OBJECTIVE: To investigate the potential role of a newly identified cyclin-dependent kinase-like protein, PFTK1 in differentiation and also study the related mechanisms.

METHODS: siRNA technology and western blot assay were used to examine the differentiation markers of OLN-93 and the activation condition of corresponding signal pathways.

RESULTS AND CONCLUSION: With serum-deprivation, OLN-93 underwent differentiation simultaneously. When PFTK1 was silenced by siRNA technology, OLN-93 differentiation was significantly improved, as judged by morphological observations. Accordingly, western blot results showed a marked increase of differentiation markers cyclic nucleotide phosphodiesterase and myelin oligodendrocyte glycoprotein in PFTK1-silenced cells. From the study on PFTK1-related signaling pathways, we found that PFTK1 silencing induced the activation of PI3K/AKT pathway but not MAPK/ERK pathway. Furthermore, the inhibition of AKT by its specific inhibitor abrogated PFTK1 silencing-promoted OLN-93 differentiation. Taken together, our data demonstrate that PFTK1 negatively regulates OLN-93 differentiation through PI3K/AKT pathway, providing a clue for developing new therapeutic approaches to treat degenerative neurological diseases related to demyelination.

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Key words: Oligodendroglia, Cyclin-Dependent Kinases, Gene Silencing

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

2.1 PFTK1基因沉默促进OLN-93细胞向少突胶质细胞分化结果少突胶质前体细胞未分化时呈典型的圆形胞体和双极突起结构。血清移除后少突胶质前体细胞自发分化：细胞体变成扁平状，且具有清晰的网状“分枝”结构。为了解PFTK1在少突胶质前体细胞分化中的作用，实验使用siRNA技术对OLN-93细胞的PFTK1基因进行了沉默表达。见图1所示，当细胞转染了PFTK1 siRNA表达质粒后，和转染对照质粒的细胞相比，PFTK1的蛋白表达水平明显下调(P < 0.001)。形态观察显示，0 d时对照细胞具有典型的少突胶质前体细胞结构：圆形胞体和双极突起结构(少数含三极突起)，且胞体周围没有“分枝”状纤维结构。PFTK1基因沉默后，同时期(0 d)细胞的双极突起消失，细胞呈扁平状，细胞具有清晰的网状“分枝”结构。该结构与成熟的少突胶质细胞相似。接着，对OLN-93细胞进行了分化诱导。当培养基中的血清被移除后，OLN-93细胞开始自发分化。诱导2 d时，PFTK1基因沉默细胞的网状“分枝”结构明显增多，而对照细胞大多数仍处于未分化状态。诱导4 d后，对照细胞的分化明显增加，但其分化程度仍低于PFTK1沉默细胞。形态观察结果提示PFTK1的下调对少突胶质前体细胞OLN-93的分化具有明显的促进效果。

2.2 PFTK1基因沉默促进OLN-93细胞分化标志物的表达形态观察的结果不足以说明PFTK1基因对OLN-93细胞分化的影响。接着实验分析了PFTK1基因沉默对少突胶质细胞分化的分子标志物诱导表达的影响。通过Western印迹分析，发现PFTK1基因沉默的细胞的OL分化标志物-环核苷酸磷酸二酯酶和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的诱导表达水平显著高于对照细胞，分别为对照细胞的2.3倍(P < 0.01)和2.1倍(图2)，差异均有显著性意义(P < 0.01)。该结果进一步证实了前面形态观察的结果，表明PFTK1对OLN-93细胞分化存在抑制作用。

2.3 PFTK1基因沉默诱导PI3K/ATK信号通路的活化结果以往的研究结果显示，PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路在少突胶质前体细胞分化中起重要作用^[13-14]。为了解PFTK1对OLN-93细胞分化的具体作用机制，实验对这两种信号通路的活化情况进行了分析。图3显示，PFTK1基因沉默后，p-AKT的信号强度明显增强，而p-ERK1/2的信号无显著变化。由于p-ATK和p-ERK1/2的水平分别反映PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路的活化情况，该结果提示PFTK1可能参与了对PI3K/AKT信号通路的调控。

2.4 PFTK1通过对PI3K/ATK信号通路的调控影响OLN- 93细胞分化结果前面结果显示PFTK1对PI3K/ATK信号通路存在调控作用，但该调控作用是否对OLN-93细胞分化存在直接影响并不清楚。鉴于此，实验利用ATK的特异性抑制剂LY292004(LY)对PI3K/ATK信号通路进行阻断，观察PFTK1沉默对OLN-93细胞分化的促进作用是否受到影响。见图4，10 μmol/L的LY292004可完全阻断PFTK1沉默诱发的p-ATK信号，其p-ATK信号甚至低于对照细胞(siCtl).提示可接着进行下一步的研究。

接着，实验用Western印迹实验分析了LY292004对OLN-93细胞分化标志物诱导的影响。如图显示，10 μmol/L的LY292004可显著抑制PFTK1沉默对OLN-93细胞分化的促进作用。和未经LY292004处理的PFTK1沉默细胞相比，LY292004处理后的细胞中环核苷酸磷酸二酯酶和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的蛋白质表达水平显著降低，分别为后者的32.9% (P < 0.01)和38.9% (P < 0.01)，差异均有显著性意义。该结果提示PFTK1可通过对PI3K/ATK信号通路的调控影响OLN-93细胞分化。

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引言

材料方法

设计：PFTK1影响少突胶质前体细胞分化机制的体外研究实验。

时间及地点：于2011年1月至2013年7月在新加坡南洋理工大学及2013年8月至2014年10月在新乡医学院生命科学技术学院干细胞中心完成。

实验方法：

大鼠少突胶质前体细胞系OLN-93细胞分化：用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM，37 ℃、体积分数5% CO₂、饱和湿度条件下对OLN-93细胞进行生长培养。分化时，取生长良好的OLN-93细胞以1×10⁹ L^-1浓度接种于孔底6孔板上，静置48 h。观察细胞贴壁后小心吸去培养基，用PBS洗涤1次。然后加入3 mL不含血清的DMEM细胞培养基处理细胞2 d或4 d。

质粒构建：使用siRNA表达载体pSilencer^TM 4.1-Neo构建含PFTK1特异性的siRNA表达质粒。分别合成一对PFTK1和一对阴性对照的寡核苷酸：5’-GAT CCG ACG ACA CCA CCT TTG ATG TTC AAG AGA CAT CAA AGG TGG TGT CGT CAG A-3’和 5’-AGC TTC TGA CGA CAC CAC CTT TGA TGT CTC TTG AAC ATC AAA GGT GGT GTC GTC G-3’ (PFTK1)； 5’-GAT CCG AGC ACA TAT CCT CCG ATG TTC AAG AGA CAT CGG AGG ATA TGT GCT CAG A-3’和 5’-AGC TTC TGA GCA CAT ATC CTC CGA TGT CTC TTG AAC ATC GGA GGA TAT GTG CTC G-3’(阴性对照)。将成对的寡核苷酸94 ℃变性后再复性，并克隆至BamHⅠ/Hind Ⅲ双酶切处理的pSilencer^TM 4.1-neo中。经过DNA测序，得到阳性克隆，分别命名为psiPFRK1和psiCtl。

细胞转染和筛选：用电穿孔技术将psiPFRK1和psiCtl转染至OLN-93细胞中，转染条件为1 400 mV，30 ms。电击后将细胞铺到培养皿中进行培养，48 h后用含800 mg/L的G418对细胞进行筛选。1周后将混合的G418抗性细胞用于以后的研究。

Western印迹分析：细胞处理完成后弃掉培养基，用预冷的PBS洗2遍，加入Lysis Buffer裂解液，超声破碎仪破碎20 s，12 000 r/min离心20 min，取上清，采用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDS?PAGE分离，转移到PVDF膜上。用5%的脱脂牛奶(用0.1%的PBST稀释)封闭1.5 h，加入一抗室温孵育2 h，也可4 ℃孵育过夜。用洗膜缓冲液漂洗5 min×3次，根据一抗的种属来源加入相应的二抗，室温孵育1 h，洗膜缓冲液漂洗5 min×3次。将PVDF膜用发光剂ECL显色后曝光到X射线片上，用专业软件Image J1.48 (National Institutes of Health，美国)进行灰度分析。

主要观察指标： ①PFTK1基因沉默促进OLN-93细胞向少突胶质细胞分化结果。②PFTK1基因沉默促进OLN-93细胞分化标志物的表达。③PFTK1基因沉默诱导PI3K/ATK信号通路的活化结果。④PFTK1通过对PI3K/ATK信号通路的调控影响OLN-93细胞分化结果。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学处理。数据以x(_)±s表示，各组间观察指标的比较采用单因素方差分析和最小显著差法，检验水准α值取双侧P < 0.05。

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讨论

PFTK1是一个新近发现的周期蛋白依赖性蛋白激酶成员，和其他周期蛋白依赖性蛋白激酶分子一样，PFTK1参与了对细胞增殖的调控。对PFTK1的过表达可促进细胞增殖，对其基因的沉默则导致细胞周期停滞在G1期。哺乳动物细胞内，PFTK1可特异性地与细胞周期蛋白D3结合，并与p21^Cip1形成三聚体^[15]。除此，它还能与细胞周期蛋白Y结合，促进非经典的Wnt信号通路的活化^[16]。由于PFTK1可促进肝癌细胞的侵袭和移动能力，或被用来预测食管鳞状细胞癌，因此一些学者认为PFTK1是一种癌基因^[17-18]。本研究结果首次证实了PFTK1除了具有调节细胞周期的功能外，还对少突胶质前体细胞的分化具有负调节作用。此外，实验还发现PFTK1可借助PI3K/ATK信号通路实现对少突胶质细胞分化的调控。

少突胶质细胞分化是一个多步骤的过程，分化的起始往往伴随着细胞周期的退出(withdrawal)。而细胞周期的退出主要由周期蛋白依赖性蛋白激酶和它们的内源性抑制蛋白(CKIs)控制。周期蛋白依赖性蛋白激酶对OL分化的影响，研究较多的是周期蛋白依赖性蛋白激酶2和5^[7-10]。少突胶质细胞分化时常伴随周期蛋白依赖性蛋白激酶5的激活，而周期蛋白依赖性蛋白激酶5特异性阻断剂可抑制少突胶质细胞分化，提示周期蛋白依赖性蛋白激酶5对少突胶质细胞分化起正调控作用^[10]。与之相反，周期蛋白依赖性蛋白激酶2在少突胶质细胞分化中可能其负调控作用，这是由于体内和体外的研究均发现，少突胶质细胞分化时周期蛋白依赖性蛋白激酶2的激酶活性会相应下降。本研究则发现，PFTK1基因的表达下调可促进体外培养的OLN-93细胞向成熟的少突胶质细胞分化。综合本实验和其他学者的研究结果，不难发现PFTK1在少突胶质细胞分化中的作用同周期蛋白依赖性蛋白激酶5相反，而与周期蛋白依赖性蛋白激酶2具有较高的相似性。以往的研究显示，无论在体外还是体内少突胶质细胞的分化和髓鞘形成过程中，AKT和ERK信号通路均发挥着重要的调节作用^[13-14]。已知少突胶质细胞分化主要包括2个阶段：从少突胶质前体细胞到未成熟的少突胶质细胞；从未成熟的少突胶质细胞到成熟的少突胶质细胞。ERK信号调控前体细胞向未成熟的少突胶质细胞过渡，对未成熟的少突胶质细胞向成熟少突胶质细胞过渡则无调节作用^[19]。与此相反，AKT信号则为未成熟的少突胶质细胞向成熟少突胶质细胞过渡时所需。本研究中，作者试图研究PFTK1的这两个信号转导途径的影响。结果发现，OLN-93细胞的分化需要AKT信号的参与，而不需要ERK信号的参与PFTK1可能通过下调AKT信号进而抑制OLN-93细胞的分化。本实验的发现与以前的研究结论基本一致，即AKT信号通路的活化与少突胶质细胞分化的第二阶段相关。这是因为近期的一项研究提示，OLN-93细胞系实际上是一种未成熟的少突胶质细胞，而不是一个真正的前体细胞^[20]。需要指出的是，PFTK1如何影响AKT信号通路，仍需要做进一步的深入研究。

总之，实验结果表明，PFTK1是少突胶质细胞分化的一种有效的抑制剂。 PFTK1可以改变多个分化标志物，如环核苷酸磷酸二酯酶和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白的表达水平，并且导致OLN-93细胞发生相应的形态学改变。此外，该周期蛋白依赖性蛋白激酶可通过对PI3K/ATK信号通路的调节来影响少突胶质细胞分化。

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